سوال: چرا سرم هایAustralia origin از نظر کیفیت و قیمت اختلاف زیادی با سرم های برزیلی دارند؟ سرم های فارما گرید (medsuite)چه مزیتی دارند؟

آریافن: فاکتور رشد در سرم های استرالیایی و pharma grade بالاتر از مابقی سرم هاست و برخی محققین نسبت به این موضوع آگاهی ندارند، بنابرین برای کشت های Primary که زیاد انجام می شود و سلول هنوز سازگار نشده است باید از این نوع سرم ها استفاده کرد تا بهترین جواب چه از نظر چسبندگی سلولها و چه از نظر سرعت رشد سلول ها بدست آید. از طرفی ریسک جنون گاوی در سرم های استرالیایی به مراتب کمتر از سایر سرم هاست. تست های ویروسی زیادی بر روی سرم های فارما گرید که عمدتا با منشاء استرالیایی و یا آمریکایی هستند انجام شده بنابراین می توان با خیال راحت در مراکز درمانی بر روی انسان کار کرد.

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها:

مشکل: مشاهده رسوب در محیط، بدون تغییر PH
دلایل احتمالی و راه حل:
1- فسفات فسفات موجود در محلول شستشو که می تواند باعث رسوب اجزاء محیط شود :
شستشوی ظرف کشت با آب دیونیزه یا آب مقطر در چند مرحله و استریل کردن آن
2- یخ زدن محیط قبل از استفاده :
محیط را تا دمای 37 درجه گرم کرده و تکان دهید در صورتی که رسوبات حل نشد آن را اوت کنید.

سوال: چرا گاهی اوقات پس از عملیات کشت سلول، محیط در مدت زمان مورد انتظار تغییر رنگ نمی دهد؟

آریافن: در صورتی که رنگ محیط کشت پس از استفاده بر روی سلول بعد از سه روز تغییر رنگ نداد (زرد نشد) معمولا اولین مشکل ممکن است مربوط به ترکیب نامناسب محیط باشد که خود می توانند دلایل مختلف داشته باشد مثلا اینکه تاریخ انقضای آن گذشته باشد. مشکل دیگر ممکن است از نوع سرم استفاده شده باشد. اگر سرم شما حاوی فاکتورهای رشد کافی نباشد سلول خوب رشد نمی کند بنابراین نمیتواند دی اکسید کربن لازم را برای زرد شدن محیط تولید کند. این در صورتی اتفاق می افتد که محقق از سرم های نامرغوب استفاده کرده باشد.

سوال: پیشنهاد شما برای استفاده از FBS (Plus) و FBS (Standard) چیست؟ کدام بهتر است؟

آریافن: سرم های Plus نسبت به سرم های استاندارد برتری خاصی ندارد جز اینکه مقدار فاکتورهای رشد و دیگر پروتئین های موجود در آن معین و تعریف شده است. که با توجه به روش کار و نوع سلول می توان یکی از این دو را پیشنهاد داد. بهتر است که سرم های Plus را برای non-adherent cell culture استفاده کرد اما اگر دقیقا نمی دانید که کدام سرم را انتخاب کنید پیشنهاد ما اینست که از سرم های استاندارد استفاده کنید. لازم به ذکر است که برای تعیین میزان تولید برخی فاکتورها توسط سلول خصوصا در مراکز صنعتی از سرم Plus استفاده می شود.

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها:
مشکل: مشاهده آلودگی در کشت های اولیه (Primary cell culture)
دلیل احتمالی :
وجود آلودگی در بافتی که از آن سلول گرفته شده است:
راه حل:
شستشوی بافت با محلول نمکی حاوی مقادیر بیشتری از آنتی بیوتیک ها و ضد قارچ ها قبل از کشت دادن.

سوال: منظور از کشت سلول بروش سه بعدی چیست؟ چرا باید سلول را بروش سه بعدی کشت دهیم؟

آریافن: بافت ها و اندام ها در بدن به شکل سه بعدی وجود دارند بنابراین کشت سه بعدی در جهت برقراری فعالیت و مورفولوژی سلولی تمایز یافته عمل می کند. از طرفی مطالعه سلول ها به شکل سه بعدی پژوهشگران را قادر به تشخیص شرایط فیزیولوژیکی نزدیکتری نسبت به آنچه در بدن موجود زنده است میکند.

مفهوم IC50 به چه معناست؟
غلظتی از دارو است که باعث کاهش 50% از رشد سلول می شود.
روش های محاسبه آن در فایل زیر توضیح داده شده است.

نحوه کالیبراسیون سمپلر
سمپلر را روی آخرین مقدار خود قرار دهید، مثلا برای سمپلر 100 لاندا، روی100 لاندا یا برای سمپلر 1000 لاندا، روی 1000 لاندا تنظیم کنید و به وسیله آن یک حجم از آب مقطر را وزن کنید (از یک ترازوی دیجیتال دقیق استفاده شود). چون دانسیته آب مقطر یک است و یک گرم آب مقطر یک ml می باشد پس وزنی که ترازو نشان می دهد باید 1000 میلی گرم باشد. 3 بار این کار را به یک روش انجام دهید. دقت شود که با یک روش حجم ها را توسط سمپلر بردارید و این کار را بسیار آرام انجام دهید. از وزنهای بدست آمده میانگین بگیرید : اگر میانگین آنها کمتر یا بیشتر از 1000 لاندا بود می توانید با پیچ تنظیم کننده، آن را تغییر دهید و کالیبره نمایید. این کار را تا هنگامی که میانگین وزنها به 1000 لاندا برسد باید تکرار شود.
@cellculture

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها:
مشکل: مشاهده آلودگی در کشت های اولیه (Primary cell culture)
علت و راه حل:
آلودگی در بافتی که از آن سلول گرفته شده است:
شستشوی بافت با محلول نمکی حاوی مقادیر بیشتری از آنتی بیوتیک ها و ضد قارچ ها قبل از کشت دادن.
@cellculture

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها:
مشکل: سلول ها در کشت سوسپانسیون با هم مجتمع شده و می چسبند
دلایل احتمالی و راه حل ها :
1- حضور یون های کلسیم و منیزیم:
الف) سلول ها را در یک محلول نمکی موازنه بدون کلسیم و منیزیم بشوئید و در نهایت با پیپتاژ یک سوسپانسیون از سلول ها منفرد برداشت کنید.
2- آلودگی با مایکوپلاسما:
الف) از کشت تست مایکوپلاسما گرفته و انکوباتور و هود را ضدعفونی کنید اگر آلودگی ادامه یافت کشت را اوت کنید.
3- لایز سلولی و تخلیه DNA ناشی از فعالیت آنزیم های پروتئولایتیک:
الف) تیمار سلول ها با آنزیم DNase I به میزان یک هزارم درصد.
ب) شستشوی سلول ها با محلول PBSو کشت سلول ها در محیط تازه.
@cellculture

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها
مشکل: مرگ سلول ها
دلایل احتمالی و راه حل:
1- عدم وجود CO2 در انکوباتور:
الف) میزان CO2 را در انکوباتور کنترل کنید.
ب) نشتی یا باز ماندن در انکوباتر را بررسی کنید.
2- تغییر دما در انکوباتور:
الف) دمای انکوباتور را کنترل کنید.
3- استفاده از آنتی بیوتیک ها و ضد قارچ ها در غلظت های سمی:
الف) استفاده از اینگونه معرف ها در مقادیر کمتر، باید توجه داشت که برای محیط ای سرم فری 10 برابر کمتر از محیط های معمولی به آنتی بیوتیک ها نیاز است.
4- آسیب دیدن سلول ها طی فریز و دفریز کردن:
الف) استفاده از یک آلیکوت سلولی دیگر
5- فشار اسمزی نامناسب محیط:
الف) فشار اسمزی محیط نهایی را چک کنید، توجه داشته باشد که سلول های پستانداران می توانند اسمولالیته 260-350 mOsm/kg را تحمل کنند. افزودن بافر HEPES و داروها ممکن است بر اسمولالیته اثر گذارد. نکته دیگر اینکه سلول های حشرات نیازمند محیط هایی با اسمولالیته بیشتری نسبت به سلول های پستانداران می باشند: 340-380 mOsm/kg
6- افزایش تدریجی متابولیت های سمی در محیط :
الف) حذف محیط و افزودن محیط تازه
@cellculture

عیب یابی در کشت سلول، دلایل احتمالی و راه حل ها
مشکل: کاهش رشد سلول ها
دلایل احتمالی و راه حل :
1- تغییر در محیط یا سرم:
الف) فرمولاسیون محیط را برای بررسی مقادیر گلوکز، آمینواسید و اجزاء دیگر چک کنید.
ب) لات نامبر سرم قبلی را با سرم جدید چک کنید.
ج) مقدار تلقیح سلول های اولیه را افزایش دهید
د) سلول ها تدریجا با محیط جدید سازگار کنید.
2- کاهش یا عدم وجود محرک های رشد مانند L-glutamine یا فاکتورهای رشد.
دلایل احتمالی و راه حل :
الف) حذف محیط و اضافه کردن محیط تازه
ب) اضافه کردن محرک های رشد به محیط.
ج) استفاده از GlutaMAAX بجای L-glutamine در محیط.
3- آلودگی جزئی با قارچ یا باکتری:
الف) سلول را بدون آنتب بیوتیک کشت دهید اگر آلودگی زیاد شد آن را اوت کنید.
4- نامناسب بودن شرایط دمایی ذخیره معرف ها:
الف) سرم را باید در 5 تا 20 درجه زیر صفر نگهداری کرد و محیط را در 2 تا 8 درجه بالای صفر در تاریکی.
ب) محیط و سرم در حداقل قرارگیری در نور باشند (طی عملیات کشت)
5- تلقیح اولیه به مقدار کم انجام شده است
الف) افزایش تلقیح سلول های زنده
6- پیر شدن سلول ها:
الف) کشت را اوت کرده و از استوک سلولی تازه استفاده کنید.
7- آلودگی با مایکوپلاسما:
الف) از کشت تست مایکوپلاسما گرفته و انکوباتور و هود را ضدعفونی کنید اگر آلودگی ادامه یافت کشت را اوت کنید.
@cellculture